Cietokšņa celtniecības sākumposmā Dinaburgā darbojās kara hospitālis ar 300 vietām.
1820. gadā pēc arhitekta A.Štauberta projekta cietoksnī uzsāka hospitāļa celtniecību ar 500 gultas vietām. Celtniecību pabeidza 1827. gadā, un par pirmo hospitāļa galveno ārstu kļuva Jefrems Adamovičs. Hospitālī darbojās aptieka, kuru XIX gs. 70. gados vadīja ievērojamais farmaceits Melhiors Kubli, kurš nodarbojās arī ar Krāslavas minerālavotu izpēti.
1837. gadā hospitāli paplašināja līdz 900 gultas vietām, un tas kļuva par vienu no nozīmīgākajām 4. klases kara medicīnas iestādēm Krievijā. Bet ar laiku, samazinoties gultas vietu skaitam un medicīnas pakalpojumu klāstam, hospitālim piešķīra zemāku kategoriju – sākumā 3. klasi, vēlāk - 2. klasi, bet Pirmā pasaules kara priekšvakarā tas tika pārveidots par kara lazareti.
No 1874. gada hospitālī notika žēlsirdīgo māsu apmācība.
1882. gadā Dvinskā (Daugavpilī) nodibināja Medicīnas darbinieku biedrību, kurā aktīvi darbojās arī hospitālī strādājošie ārsti. Hospitāļa Acu nodaļas vadītājs S.Fialkovskis kļuva par biedrības pirmo sekretāru, bet 1883.-1889. gadā - par tās priekšsēdētāju.
Pirmā pasaules kara laikā hospitālī ārstējās krievu armijas militārpersonas, bet vācu karagūstekņiem tika izveidota speciāla nodaļa. Kara beigās cietoksnis un hospitālis bija tukšs.
20. gs. 20.-30. gados hospitāļa ēkā atradās Latvijas Armijas kara slimnīca. Tās darbība sākās ļoti sarežģītos apstākļos. Stāvoklis uzlabojās tikai pēc armijas Sanitārā dienesta izveidošanas.
1928. gadā Daugavpils kara slimnīcā tika izveidoti tam laikam atbilstoši fizioterapijas un rentgenoloģijas kabineti, bet 1931. gadā atklāja specializētas acu un ausu - deguna nodaļas. 1930. gadā tika modernizēta slimnīcas virtuve un uzstādītas jaunas veļas mazgājamās mašīnas. 1934. gadā uzstādīta stacionāra dezinfekcijas kamera. 1935. gadā Mežciemā atklāja specializētu slimnīcas nodaļu militārpersonu bērniem ar 75 vietām, bet 1939. gadā pašā slimnīcā – bērnu infekcijas nodaļu. Vienā no cietokšņa bastioniem izveidoja parku, kur slimajiem pastaigāties. Slimnieku rīcībā bija arī liela lasītava. Daugavpils kara slimnīcā tās 15 gadu darbības laikā tika ārstējušies ap 47000 pacientu.

Kara slimnīcas vadītāji:
1920.-1921. g. – ārsts-kapteinis Blūmenfelds
1921.-1922. g. – ārsts-pulkvežleitnants Emīls Hugo Skadiņš
1922.-1930. g. – ārsts-pulkvežleitnants Jānis Alksnis
1931.-1940. g. – ārsts-pulkvežleitnants Bruno Blosfelds

1940. gadā cietoksnī tika izvietots Sarkanās Armijas hospitālis, bet, sākoties Otrajam pasaules karam, hospitāli no Daugavpils evakuēja. Kara laikā hospitāļa telpas izmantoja vācu okupācijas karaspēka daļas.
1944. gada rudenī darbu atsāka PSRS Kara ministrijas hospitālis. Garnizona hospitālī bija 4 nodaļas ar 100 gultasvietām: ķirurģiskā, terapeitiskā, ādas-veneroloģiskā un infekcijas nodaļa. Cietokšņa hospitālī ārstējās Daugavpils Kara daļas karavīri un virsnieki, kara veterāni un viņu ģimenes locekļi.
Pēc Augstākās tehniskās aviācijas skolas izvešanas no Daugavpils cietokšņa hospitālis pārtrauca savu darbību. Ārsti, medicīniskais personāls un tehniskais aprīkojums tika pārvietoti uz Stavropoli.